Oxford Nanopore Technologies: sequenziamento long-read per l'ottimizzazione dell'analisi diagnostica di malattie monogeniche rare

The diagnosis of rare monogenic diseases remains often incomplete to this day, due to the limitations of short-read sequencing technologies. As a result, a promising alternative in the diagnostic field is the use of long-read sequencing techniques, which are capable of detecting genetic variants that short-read methods typically miss. The study analyzed in this paper aims to explore the principles and potentials of long-read sequencing using the Oxford Nanopore platform, with a specific focus on identifying variants responsible for rare monogenic disorders. In the article, the authors present Napu, a dedicated bioinformatics pipeline designed for the analysis of long-read sequencing data derived from isolated DNA, white blood cells, or whole human blood samples. The pipeline includes several key steps: de novo assembly of diploid genomes, detection of structural variants, single-nucleotide variants, and insertions/deletions, haplotype reconstruction, and profiling of haplotype-specific DNA methylation, ultimately culminating in the generation of a complete clinical report. Furthermore, the study presents a comparative analysis between short-read and long-read sequencing, assessing their respective capabilities in genome assembly and variant detection. The findings demonstrate the strong clinical-diagnostic potential of long-read sequencing, supporting its value as a complementary and potentially decisive tool in the diagnosis of rare monogenic diseases.

La diagnosi di malattie monogeniche rare ad oggi rimane spesso incompleta a causa delle limitazioni delle tecniche di sequenziamento short-read. Pertanto, una soluzione possibile è l’utilizzo in ambito diagnostico di tecniche di sequenziamento long-read, che rilevano varianti genetiche inaccessibili al sequenziamento short-read. Lo studio analizzato in questo elaborato mira a comprendere i principi e le potenzialità del sequenziamento long-read su piattaforma Oxford Nanopore, concentrandosi sul rilevamento di varianti che causano malattie monogeniche rare. Nell’articolo gli autori presentano la pipeline Napu, sviluppata per l’analisi dei dati di sequenziamento long-read ottenuti da campioni di DNA isolato, globuli bianchi o sangue intero umano. Le fasi che costituiscono la pipeline Napu sono: l’assemblaggio de novo di genomi diploidi, la chiamata di varianti strutturali, puntiformi e di inserzione/delezione, la ricostruzione degli aplotipi e del profilo di metilazione aplotipo-specifico, infine la stesura di un report clinico integrato. Inoltre, nello studio analizzato viene svolto un confronto tra sequenziamento short-read e long-read, in termini di capacità di assemblaggio del genoma e rilevamento delle varianti genetiche, che ha portato alla dimostrazione del potenziale del sequenziamento long-read in ambito diagnostico-clinico.