Generazione di cellule prive della proteina FKRP e sviluppo di un test di potenza per la terapia genica della distrofia muscolare dei cingoli LGMDR9

LGMDR9 is a dystroglycanopathy caused by mutations in the FKRP gene, which encodes a protein required for the glycosylation of α-dystroglycan (α-DG). The genetic defect leads to severe muscle weakness for which no cure currently exists. A promising strategy consists of gene therapy based on the insertion of the FKRP gene using a recombinant adeno-associated viral vector (rAAV). To validate this new therapy, several controls are necessary: the study aims to verify the actual functionality of the drug and its potency. The authors first generated an FKRP-KO cell line using the CRISPR-Cas9 technique, to be employed as an in vitro model for testing rAAV-FKRP. Subsequently, they developed an On-cell Western (OCW) assay that quantifies the level of α-DG glycosylation, thus allowing batch-to-batch comparisons between different lots of the drug. The results demonstrate the validity of the OCW assay and the dose-dependent restoration of α-DG glycosylation in FKRP-KO cells transduced with rAAV-FKRP. Looking ahead, the study supports the use of these techniques not only for the validation of other gene therapies but also for further drug optimization studies.

La LGMDR9 è una distroglicanopatia causata da mutazioni nel gene FKRP che codifica una proteina necessaria per la glicosilazione dell’α-distroglicano (α-DG). Il difetto genico porta ad un grave indebolimento del muscolo per il quale, ad oggi, non esiste una cura. Una strategia promettente consiste nella terapia genica basata sull’inserzione del gene FKRP con un vettore virale adeno-associato ricombinante (rAAV). Per validare questa nuova terapia sono necessari diversi controlli: lo studio si propone di verificare l’effettiva funzionalità del farmaco e la sua potenza. Gli autori hanno prima creato una linea cellulare KO-FKRP, tramite la tecnica CRISPR-Cas9, da utilizzare come modello in vitro su cui sperimentare rAAV-FKRP. In seguito, hanno sviluppato un saggio On-cell Western (OCW) che quantifica il livello di glicosilazione di α-DG e quindi permette di fare un confronto batch-to-batch tra diversi lotti del farmaco. I risultati dimostrano la validità del saggio OCW e il ripristino dose-dipendente della glicosilazione di α-DG in cellule KO-FKRP trasdotte con rAAV-FKRP. In prospettiva, lo studio supporta l’utilizzo di queste tecniche anche per la validazione di altre terapie geniche o per compiere ulteriori studi di ottimizzazione del farmaco.