Caratterizzazione del gene di pesco Short Vegetative Phase-like (PpeSVP-like) in gemme a fiore durante la dormienza

This thesis illustrates and applies two very important molecular techniques used for the study of gene expression: In situ Hybridization and Real-Time PCR. In Situ Hybridization is a technique that displays the expression site, or sites of gene, while RT-PCR allows you to quantify gene expression at a specific time. These techniques have been used for the characterization of the Short Vegetative Phase-like (PpeSVP-like) peach gene, which belongs to the MADS-box family, in which we also find the DORMANCY-ASSOCIATED MADS-BOX (DAM) genes that play a fundamental role in the control of dormancy in fruit trees. It has been suggested that the PpeSVP gene also plays a specific role in this process. To verify this hypothesis, the flowers and vegetative buds of the Fantasia peach cultivar were sampled at different times of dormancy (time points), in particular at 0 CU, 475 CU and 700 CU (CU = refrigeration unit). The gems were then properly processed. For the Hybridization in Situ the buds have been inserted in paraffin, a medium that gives the sample greater consistency in order to prepare it for the "cutting" in very thin sections that were then placed in "storage" slides. Meanwhile, the DNA of the gene is extracted from the buds that, after being amplified by the use of a cloning vector (plasmid), must be transcribed into RNA. At this point hybridization can be carried out: a solution is prepared containing the antisense mRNA marked with digoxigenin, which is then distributed and allowed to act on the slides. The antisense mRNA pairs with RNA sense and this allows, thanks to the link between digoxigenin and the dye Nitroblutetrazole (NBT), to highlight the parts of the gem where the gene is expressed. Instead, as for Real-Time PCR, the procedure begins with RNA extraction at each time-point; then the RNA is retro-transcribed to cDNA (complementary DNA) using specific primers. Then the RealTime PCR is carried out and it will provide the data related to the quantification of the gene. The results obtained have confirmed the initial hypothesis, the PpeSVP gene is therefore more expressed in the buds during the winter period, in particular during the dormancy. Its expression is reduced with the meeting of the "chilling requirement". Moreover, it has been observed that it is mainly expressed in the stamens, this could lead us to think that it has a role also in the male gametophyte formation (pollen grain).

Il presente lavoro di tesi illustra e applica due tecniche molecolari molto importanti utilizzate per lo studio dell’espressione genica: l’Ibridazione in Situ e la Real-Time PCR. L’Ibridazione in Situ è una tecnica che permette di visualizzare il sito, o siti di espressione di un gene, mentre la RT-PCR consente di quantificare l’espressione di un gene in un momento specifico. Queste tecniche sono state utilizzate per la caratterizzazione del gene di pesco Short Vegetative Phase-like (PpeSVP-like), che appartiene alla famiglia dei MADS-box, all’interno della quale troviamo anche i geni DORMANCY ASSOCIATED MADS-BOX (DAM) che hanno un ruolo fondamentale nel controllo della dormienza negli alberi da frutto. Si è ipotizzato, quindi, che anche il gene PpeSVP abbia un ruolo specifico in questo processo. Per verificare questa ipotesi sono state campionate le gemme a fiore e vegetative della cultivar di pesco Fantasia in differenti momenti della dormienza (time points), nello specifico a 0 CU, 475 CU e 700 CU (CU = Chilling Units). Le gemme sono state poi adeguatamente processate. Per l’Ibridazione in Situ le gemme sono state incluse in paraffina, un mezzo che dona al campione maggiore consistenza al fine di prepararlo al “taglio” in sottilissime sezioni che sono state poi poste in vetrini “porta-oggetti”. Nel frattempo, viene estratto il DNA del gene dalle gemme che, dopo essere stato amplificato tramite l’utilizzo di un vettore di clonaggio (plasmide), deve essere trascritto a RNA. A questo punto si può procedere con l’ibridazione: viene preparata una soluzione contenente l’mRNA antisenso marcato con digossigenina, che viene poi distribuita e lasciata agire sui vetrini. L’mRNA antisenso si appaia con l’RNA senso e questo permette, grazie al legame tra la digossigenina e il colorante nitroblutetrazolio (NBT), di evidenziare le parti della gemma dove viene espresso il gene. Per quanto riguarda la Real-Time PCR, invece, la procedura inizia con l’estrazione dell’RNA ad ogni time-point; l’RNA viene poi retro-trascritto a cDNA (DNA complementare) tramite l’utilizzo di specifici primer. Si avvia quindi la Real-Time PCR che fornirà i dati relativi alla quantificazione del gene. I risultati ottenuti hanno confermato l’ipotesi iniziale, il gene PpeSVP viene quindi molto espresso nelle gemme durante il periodo invernale, in particolare durante l’endo-dormienza. La sua espressione viene ridotta man mano che viene soddisfatto il “fabbisogno di freddo”. Inoltre, si è visto che viene espresso principalmente negli stami, questo potrebbe portare a pensare che abbia anche un ruolo nella formazione dei gametofito maschile (granulo pollinico).