Produzione di tirosolo in Synechocystis sp. PCC 6803 mediante biocatalisi whole cell

I cianobatteri sono un phylum di batteri rilevanti a livello biotecnologico per la loro abilità di crescere in autotrofia, eterotrofia e mixotrofia, per la naturale competenza a integrare DNA esogeno e, soprattutto, per la relativa efficienza di ricombinazione omologa. La biologia sintetica e l’ingegneria metabolica si stanno interessando sempre di più a questi microrganismi per scopi industriali. Recentemente, si è manifestato un crescente interesse nell'utilizzo dei cianobatteri come ospiti per la biocatalisi, rivelando un potenziale come risorsa sostenibile ed eco-compatibile per la produzione di diversi prodotti. In questo contesto, la presente tesi si propone di esaminare la possibilità di utilizzare un ceppo transgenico di Synechocystis sp. PCC 6803, esprimente l'enzima Baeyer-Villiger monoossigenasi da Cyanidioschyzon merolae (CmBVMO), per la produzione di tirosolo e potenzialmente anche del suo derivato, la salidroside. Il progetto è strutturato attorno a due obiettivi principali. Inizialmente, si mira a ottenere ceppi transgenici stabili di Synechocystis sp. PCC 6803, trasformandoli con un plasmide integrativo contenente il gene codificante per la CmBVMO. Questo enzima, centrale in questo progetto, è in grado di catalizzare la produzione di tirosolo a partire dal substrato 4-(4-idrossifenil)-2-butanone, una reazione difficilmente ottenibile con metodi convenzionali di sintesi organica. Questa fase prevede la clonazione del gene codificante per CmBVMO in vettori integrativi per Synechocystis e l’esecuzione di sub-clonaggi con crescenti concentrazioni di antibiotico per aumentare la pressione selettiva. Successivamente, dopo aver confermato l'espressione dell'enzima, sono state condotte biotrasformazioni in formato whole cell a diverse concentrazioni di substrato per verificare la produzione effettiva di tirosolo e valutare la resa complessiva. L'efficacia del ceppo considerato, denominato SuperP_CmBVMO, è stata confrontata con altri due ceppi allo scopo di compararne l’attività. Secondo obiettivo è consistito in un ulteriore ingegnerizzazione metabolica del ceppo transgenico di Synechocystis costruito. In particolare, ci si è serviti di un secondo vettore integrativo per introdurre una sequenza genica codificante per una glucosil tranferasi, chiamata UGT, capace di catalizzare la trasformazione di tirosolo in salidroside.