Valutazione della digital droplet PCR per la quantificazione di Salmonella spp. in matrici alimentari avicole

Salmonellosis is one of the most relevant foodborne zoonoses worldwide, particularly within the poultry production chain. European regulations require the absence of Salmonella spp. in food intended for human consumption. However, the conventional methods currently in use (ISO 6579) are time-consuming, labor-intensive, and, in the case of quantification (MPN method), rely on probabilistic approaches. In this context, Droplet Digital PCR (ddPCR) has emerged as a third-generation molecular technology capable of providing absolute quantification of the target genetic material, thus overcoming the limitations of Real-Time PCR and traditional microbiological methods. The aim of this study was to evaluate the applicability of ddPCR for the quantification of Salmonella spp. in poultry-derived food matrices. To this end, the method was optimized using pure DNA extracts of Salmonella enterica serovar Infantis, testing different primer/probe concentrations and annealing temperature gradients. The optimal conditions were identified as PCR mix 1 combined with an annealing temperature of 58.4 °C, which ensured superior separation between positive and negative droplets. The method was subsequently applied to chicken meat samples artificially contaminated at known concentrations. ddPCR demonstrated the ability to quantitatively detect Salmonella spp. starting from a contamination level of 10² CFU/g, showing a strong correlation between the number of detected copies/µL and the logarithm of the microbial load (R² = 0.94). Analysis of commercial chicken samples largely resulted in negative findings, likely attributable to limitations of the extraction process—characterized by multiple dilution steps and dispersion of genetic material—rather than to a true absence of the pathogen. In some cases, ddPCR nevertheless revealed traces of bacterial DNA not detected by Real-Time PCR following enrichment, suggesting the presence of non-viable cells. Overall, the results demonstrate that ddPCR is a sensitive and promising tool for the absolute quantification of Salmonella spp. in complex food matrices. However, critical aspects remain, particularly regarding DNA extraction efficiency, representativeness of sampling, and the inability to distinguish viable from non-viable cells. Further optimization and formal validation of the method are required before its potential integration into routine laboratory testing, with the aim of complementing and enhancing the official methods currently in place.

La salmonellosi rappresenta una delle principali zoonosi a trasmissione alimentare a livello globale, con particolare rilevanza nella filiera avicola. La normativa europea richiede l’assenza di Salmonella spp. negli alimenti destinati al consumo umano, tuttavia i metodi convenzionali previsti (ISO 6579) risultano laboriosi, di lunga durata e, nel caso della quantificazione (metodo MPN), basati su un approccio probabilistico. In tale contesto, la Digital Droplet PCR (ddPCR) si configura come una tecnologia di terza generazione capace di fornire una quantificazione assoluta del materiale genetico target, superando i limiti della PCR real-time e delle metodiche microbiologiche tradizionali. L’obiettivo del presente lavoro è stato valutare l’applicabilità della ddPCR per la quantificazione di Salmonella spp. in matrici alimentari avicole. A tal fine, il metodo è stato ottimizzato mediante DNA estratto da colonie in purezza di Salmonella enterica sierotipo Infantis, testando differenti concentrazioni di primer e probes nonché gradienti di temperatura di annealing. I risultati hanno individuato nella combinazione di PCR mix 1 e temperatura di 58,4°C la condizione ottimale, in grado di garantire la migliore segregazione tra droplets positive e negative ovvero separazione tra segnali positivi e negativi al target amplificato. Successivamente, il metodo è stato applicato a campioni di carne di pollo artificialmente contaminati a concentrazione nota. La ddPCR ha evidenziato la capacità di rilevare quantitativamente Salmonella spp. a partire da una contaminazione minima di 10² UFC/g, con una buona correlazione tra il numero di copie/µL rilevate e il logaritmo della carica microbica (R² = 0,94). L’analisi di campioni commerciali ha restituito in gran parte risultati negativi, verosimilmente attribuibili alle limitazioni della fase di estrazione, caratterizzata da passaggi multipli e dispersione del materiale genetico, piuttosto che a una reale assenza del microrganismo. In alcuni casi, la ddPCR ha comunque permesso di rilevare tracce di DNA batterico non evidenziabili mediante Real-Time PCR dopo arricchimento, suggerendo la possibile presenza di cellule non vitali. I risultati ottenuti dimostrano che la ddPCR rappresenta uno strumento sensibile e promettente per la quantificazione assoluta di Salmonella spp. in matrici alimentari complesse. Il progetto di tesi ha fatto emergere, tuttavia, alcune criticità legate principalmente al processo estrattivo e alla rappresentatività del campionamento, oltre che all’impossibilità di distinguere cellule vitali da non vitali. Ulteriori ottimizzazioni e una validazione formale del metodo saranno necessarie prima della sua integrazione nelle analisi di routine, con l’obiettivo di affiancare ed integrare le metodiche ufficiali attualmente impiegate.